Im April 1863 zieht Colonel Marlowe mit drei Regimentern Kavallerie der Union weit in das Hinterland der Konföderierten. Sein Auftrag lautet, Gleisanlagen und Brücken zu zerstören, über die der Nachschub des Gegners rollt. Er hat große persönliche Probleme mit Major Kendall, der die Truppe als Arzt begleitet. Bei einer Rast hört die junge Plantagenbesitzerin Hannah Hunter heimlich mit, was Marlowe plant. Kendall überrascht sie dabei, und Marlowe zwingt sie daraufhin, mit ihnen zu reiten, damit sie die Pläne nicht verraten kann. In Newton Station, dem Zielort des Einsatzes, stoßen die Kavalleristen zunächst auf keinerlei Widerstand. Doch das ändert sich bald.

Hauptdarsteller John Wayne, der in diesem Film den Oberst Marlowe spielt, verdankte seinen Durchbruch Regisseur John Ford, der ihm 1939 für die Rolle des Ringo Kid im Western-Klassiker "Höllenfahrt nach Santa Fé" großes schauspielerisches Können abverlangte. Dass der "Duke" im Kino über Jahrzehnte so authentisch wirkte, lag auch an der Übereinstimmung zwischen Filmrollen und persönlichen Überzeugungen.

Wayne hielt die Ideale des konservativen Amerika hoch, auf der Leinwand wie im privaten und gesellschaftlichen Leben .Auch John Ford (1894-1973), der mit vier Oscars für die beste Regie ausgezeichnet wurde, begann in Hollywood als Schauspieler. Im Laufe seiner Karriere entwickelte sich Ford zum Spezialisten für die Gründerzeit im Grenzland des Wilden Westens, indem er die Akteure seiner Eroberung in Szene setzte: Pioniere und Cowboys, aber auch Indianer ("Bis zum letzten Mann") und das einfache Volk ("Früchte des Zorns"). Seine Western haben ganze Generationen geprägt.

Der Film basiert auf dem Buch "The Horse Soldiers" von Harold Sinclair, das die wahre Geschichte von Colonel Benjamin Grierson erzählt, der zum Vorbild für die Filmfigur des Colonel Marlowe wurde. Der spannende Kavallerie-Western "Der letzte Befehl" ist eines der schönsten Beispiele für die Zusammenarbeit von Regie-Altmeister John Ford ("Früchte des Zorns", "Der schwarze Falke") mit John Wayne. Nachdem er dem Schauspieler 1939 mit der Hauptrolle in seinem Western "Ringo" zum Durchbruch verholfen hatte, wurde John Wayne mit seinem unverwechselbaren Hüftschwung und seinem spöttischen Blick unter halbgeschlossenen Lidern heraus zum Inbegriff amerikanischer Western-Männlichkeit. Der Film endet ein wenig abrupt, da John Ford nach dem Tode eines Stuntmans die Dreharbeiten nicht weiterführte.